کلونینگ و بیان ژن های کد کننده نواحی p1 و 3c ژنوم ویروس تب برفکی سروتیپ o و بررسی ایمنی زایی آن ها

این مطالعه با هدف همسانه سازی و بیان پروتئین های ساختاری p1 و غیر ساختاری 3c ویروس تب برفکی سروتیپ o جدا شده از استان خراسان رضوی در مخمر پیشیا پاستوریس و ارزیابی پاسخ ایمنی آن ها در خوکچه هندی، انجام گرفت. ژن های پروتئین های ساختاری p1 و غیر ساختاری 3c این ویروس تکثیر و تعیین توالی شدند و توالی های به دست آمده با توالی سایر سویه های سروتیپ o و سویه های سروتیپ های این ویروس از نظر فیلوژنتیکی مقایسه شدند. نتایج آنالیز تعیین توالی و فیلوژنتیکی نشان دادند که ژن p1 بیشترین شباهت نوکلئوتیدی و اسید آمنیه ی را با سویه سروتیپ o پاکستان pak/39/2008 به ترتیب (%93 /94) و (37/98%) داشت. ژن 3c بیشترین میزان شباهت توالی نوکلئوتیدی و اسید آمینه ی را با دو سویه سروتیپ a هندوستان aind288/07 و aind 287/96 به ترتیب با 74/93 و 100 درصد داشت. این نتایج نشان می دهند که ویروس شیوع یافته در ایران در سال 1389 ممکن است از کشورهای همسایه شرقی به ایران وارد شده باشد. در این تحقیق ژن p1-2a و 3c با دنباله های چسبان kpniو xbai توسط pcr تکثیر شدند و ژن p1-2a درون ناقل ptz57r/t الحاق و به باکتری dh5? انتقال داده شد. پس از تائید صحت همسانه سازی به روش هضم آنزیمی و pcr، ژن p1-2a و 3c به درون ناقل بیانی ppicz-b مخمر الحاق و به باکتری dh5? جهت تکثیر انتقال داده شدند. ناقل های بیانی ppicz-bp1-2a و ppicz-b3c پس از غربالگری و تائید صحت همسانه سازی به روش هضم آنزیمی و توالی یابی با آنزیم pmei خطی شده و با روش الکتروپوریشن به مخمر پیشیا پاستوریس انتقال داده شدند. مخمر پیشیا پاستوریس نوترکیب در محیط mmh کشت داده و با متانول بیان پروتئین های مورد نظر القاء شد. بیان پروتئین های p1-2a و 3c به روش لکه گذاری، sds-page و وسترن بلات تایید گردید. پروتئین های تولید شده از مخمر استخراج و با کمک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی ni-nta خالص سازی شد ند و به عنوان آنتی ژن تحریک کننده سیستم ایمنی به خوکچه های هندی تزریق شدند. نتایج این پژوهش نشان داد که ژن p1-2a در ناقل ptz57r/t و ناقل بیانی ppicz-b و ژن 3c در ناقل بیانی ppicz-b به درستی همسانه شده اند. ورود ژن های p1-2a و3c به داخل ژنوم مخمر پیشیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ با استخراج dna ژنومی مخمر و انجام pcr تائید شد. بیان پروتئین های p1-2a و 3c در مخمر به روش وسترن بلات با مشاهده باند اختصاصی پروتئین هدف کاملا تایید شدند. غلظت پروتئین های نوترکیب p1-2a و 3c با روش برادفورد به ترتیب، 100 و 40 میکروگرم در میلی لیتر اندازه گیری شدند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که نوع پروتئین نوترکیب در تحریک سیستم ایمنی در برابر ویروس تب برفکی در سطح 05/0 معنی دار بود. ولی اثر افزودن یاور در تحریک سیستم ایمنی معنی دار نبود (p>0.05). بین دو تیمار p1-2a و p1-2a3c همراه با یاور در تحریک سیستم ایمنی تفاوت معنی داری مشاهده نشد. به طور کلی می توان گفت که در این تحقیق ژن های p1-2a و 3c با موفقیت در مخمر پیشیا پاستوریس تکثیر، همسانه و بیان شدند و پروتئین های تولید شده قادر به تحریک سیستم ایمنی و تولید آنتی بادی علیه ویروس تب برفکی سروتیپ o می باشند.